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科研服务
DIGITAL SPATIAL PROFILING
数字化空间表达谱
NanoString空间组学平台总体介绍

GeoMx® Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP) 是NanoString公司联合MD安德森等多家研究单位共同开发的一项基于光学与探针技术的多组学技术平台。该平台于2019年发布,可同时实现高参数、多组学、高精度并且同时兼容石蜡包埋样本(FFPE)、新鲜冰冻样本(FF)、组织微阵列(TMA)等不同样本类型。它可以在同一临床样本中一次性测定多达上百种蛋白质,或者1833个癌症相关靶标的转录组,又或者超过 18000个靶标的全转录组,完美实现多组学研究。同时该平台还将组织病理学、贝博ballbet免疫与表达谱完美结合,在贝博ballbet微环境研究、贝博ballbet异质性与贝博ballbet免疫研究中有着强大的优势。

 

一、GeoMx DSP数字化空间蛋白质组


(一)总览


GeoMx DSP技术平台将蛋白质组的多重定量信息与组织原位信息进行整合,可在一张石蜡组织切片上实现多达上百种蛋白质的原位共分析。不同于多重免疫组化(mIHC)和多重免疫荧光技术(MultiplexedImmunofluorescence, mIF),DSP技术通过核酸探针偶联的抗体对靶蛋白质进行原位捕获,再通过特殊的光解离释放核酸探针,并运用nCounter数字标签技术实现计数定量,从而直接反映出靶蛋白质的丰度。DSP采用对抗体偶联核酸实现定量,完全消除了传统多重分析中光谱交叠的影响,大大提高了可测靶点的通量,且通过nCounter独有的分子标签技术进行计数定量,无需核酸扩增等一系列酶促反应,大大提高了数据的保真性和准确性。


1. GeoMx DSP数字化空间蛋白质组技术优势


1.1将组织病理学、贝博ballbet免疫与蛋白质表达谱完美结合,在贝博ballbet微环境研究、贝博ballbet异质性与贝博ballbet免疫研究中有着强大的优势;

1.2可在一张石蜡组织切片上实现多达上百种蛋白质的原位共分析;

1.3除了免疫细胞图谱核心Panel,还可以搭配多种不同的模块 (Modules)来满足不同的研究需求;

1.4可以额外提供多达10个定制靶标满足个性化开发需求;

1.5通过nCounter独有的分子标签技术进行计数定量,提高了数据的保真性和准确性。


2. GeoMx DSP数字化空间蛋白质组的应用方向


2.1贝博ballbet微环境研究

2.2贝博ballbet免疫治疗及药物靶向治疗研究

2.3贝博ballbet异质性研究

2.4生物标记物探索与验证

2.5转录组与蛋白质组共分析

2.6免疫学机理研究

2.7组织病理多组学研究

2.8免疫学与病理学标志物研究 


3. 研究流程


3.1  DSP蛋白质检测技术流程

待测目的蛋白质的抗体通过 UV(紫外光) 可切割接头(Linker)共价连接到含有DNA Barcode(DNA条形码)的寡核苷酸链上。通过将荧光直标的形态学标志物(Morphology Markers)与这些抗体同时进行孵育,再通过UV光解将感兴趣的区域(Region of Interest, ROI)的寡核酸链收集起来,经过与下游nCounter检测探针等试剂进行杂交,再利用NanoString nCounter系统进行数字量化,最后将数据返回到DSP进行分析,实现这些离散ROI内详细表达谱的信号解读。(具体见图一)

图一 GeoMx DSP的简单技术流程

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(1) 染色

FFPE切片使用标准流程进行抗原修复,然后与荧光成像试剂(形态学标志物的抗体,Morphology Markers)以及与偶联了DNA Barcode的待测目的蛋白质的抗体混合物进行孵育。

(2) ROI选择

DSP可支持多达4通道荧光的20倍图像。由形态学标志物染色成像建立组织的整体结构(例如,PanCK :上皮来源细胞的形态学标志物,例如:贝博ballbet细胞;SYTO-13 :细胞核染料和 CD45 :免疫细胞的形态学标志物)。基于形态学标志物的成像信息圈选 ROI以进行多重分析。

(3) 局部寡核苷酸释放

对选定的 ROI 进行紫外光照射释放寡核苷酸链。

(4) 寡核苷酸收集

通过微毛细管(吸样针)收集已释放到载玻片上方水性液体中的光裂解寡核苷酸,并放入 96 孔板中用于后续定量。针对不同的 ROI 进行局部紫外光照射和寡核苷酸收集(步骤 (3)-(5)),并在每个循环之间进行大量清洗。

(5) 定量

与NanoString的荧光条形码检测探针等杂交,使用标准NanoString nCounter分析系统量化,使每个ROI能够对高达约100万个结合事件进行数字计数。

(6) 数据生成和分析

nCounter读数返回DSP后将被处理成数字计数并映射回每个ROI,生成组织结构内的蛋白质图谱。蛋白质的表达矩阵将进行下游数据质控和分析。


3.2  蛋白质组信息分析流程

DSP数据分析是一个基于服务端的交互式分析系统,根据研究目的不同,开展以用户为主导的个性化分析。数据分析基本流程如下图所示:

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3.3  蛋白质组信息分析内容

DSP数据分析软件可对数据进行处理和统计分析,并导出热图、箱线图、柱状图等适于文章发表的结果呈现形式,可以很精确地分析不同区域中的蛋白质表达谱。通过不同质控的设定,包括管家基因(HK)以及IgG对照,来实现实验流程各个环节的把控。

3.3.1 标准分析

1.数据QC质控和过滤

2.数据标准化处理

3.蛋白质表达谱总览

4.PCA主成分分析

5.样本AOI/ROI表达相关性分析

6.蛋白质Marker表达相关性分析

7.蛋白质差异表达分析

8.贝博ballbet免疫微环境细胞富集分析

9.贝博ballbet免疫微环境细胞差异分析

3.3.2 定制化分析

可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析服务内容。

3.3.3 分析结果示意图

所有分组蛋白质表达热图

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PCA降维

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蛋白质相关性分析

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差异蛋白质火山图

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TME细胞丰度箱线图

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数字化空间蛋白质组检测产品

样本要求

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产品服务列表

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Core和Modules的信息

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产品服务流程

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项目周期

标准流程从样本接收质控合格到数据交付(包括样品HE质控时间),运转周期约为 2个月(40 个工作日), 每批次96AOIs以上需额外增加时长,选择个性化信息分析条目需额外评估项目周期。

 

交付指标和售后服务

1. 根据合同规定完成分析。

2. 提交项目结题报告文档,说明项目完成情况。

3. 分析过程中产生的项目结题报告、下机原始数据以及相关生物信息分析结果文件。如果数据量小于 100G,使用阿里云提供;因网络等原因无法顺利下载的,可提供移动硬盘传输;如果数据量大于 100G,所有数据将会使用移动硬盘传输。

4. 数据交付后 6 个月内,提供免费的项目咨询服务。

5. 最终数据提供后,可继续保留数据 3 个月,如需延长数据保存时间需做费用评估。

 

产品服务优势

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案例分析


利用多组学研究放疗对前列腺癌免疫微环境的改变


研究背景:

前列腺癌(PCa)具有高度免疫抑制的微环境,免疫排斥反应普遍,淋巴细胞浸润少,免疫激活水平低。高剂量辐射已被证明可以刺激人体各种实体瘤的免疫系统。我们假设局部放疗,以高剂量率近距离放疗(HDRBT)的形式,可以克服PCa的免疫抑制。

研究思路:

利用nCounter、DSP和mIHC多组学平台分析24例以HDRBT为主治疗的局限性PCa患者放疗前和放疗后的人体组织。使用已发表的16基因贝博ballbet发炎指数(TIS)将贝博ballbet分为不同的免疫激活状态(高 :热;中; 低:冷)。

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研究结果:

HDRBT将80%的“冷”表型贝博ballbet转化为“中间”或“热”类。DSP显示,这些HDRBT引起的前列腺TIS评分的变化来自于非贝博ballbet区域。TIS的这些变化还与免疫细胞密度的普遍变化有关,特别是T细胞亚群和抗原呈递细胞之间的空间关系。HDRBT诱导免疫细胞联合发生了显著变化,包括贝博ballbet区域获得的T细胞和HMWCK+PD-L1+ 相互作用。

Simon P Keam, et al. High dose-rate brachytherapy of localized prostate cancer converts tumors from cold to hot. J ImmunoTherapy of Cancer. 2020 Nov 8(S uppl 3): A614-A615. DOI: 10.1136/jitc-2020-SITC2020.0580

发表单位:Peter MacCallum Cancer Center

影响因子:9.913


常见问题FAQs


Q1. 什么样品类型适合使用GeoMx DSP技术进行空间信息分析?

DSP 技术可以用于各种组织类型: 包括正电荷粘附载玻片固定的 (+ charged slides mounted) 石蜡包埋组织 (FFPE) 切片和新鲜冻存(FF)组织切片。 在 NanoString 总部的 TAP (Technical Access Program) 服务项目中, 已经在DSP上成功验证过 55 种以上的各类贝博ballbet组织, 如下图所示: 包括贝博ballbet组织、 穿刺样品、 骨髓和皮肤等各类组织。 DSP 也兼容各类样品类型,包括石蜡切片、 冷冻组织、 组织芯片和细胞培养切片等。具体可执行样本类型,请咨询当地业务负责人。

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Q2. 对于使用 nCounter 技术作为 GeoMx DSP 空间分析下游定量技术的项目,分析过程中是否有PCR扩增?

对于 DSP蛋白质检测的下游 Oligo 标签(含有 DNA Barcode的寡核苷酸链)定量步骤,如果采用 nCounter 平台的话,不需要反转录或 PCR 扩增步骤和建库过程,可以直接用 nCounter 平台对 Oligo 标签进行定量,无需建库过程。nCounter技术对于Oligo标签或RNA分析的定量原理如下图所示,通过杂交两段探针:Capture Probe和Reporter Probe,检测 Reporter probe 的荧光信号组合来实现对 Oligo 标签的直接单分子定量分析。一个检测到的荧光Reporter probe对应一个Oligo标签分子或RNA分子,可以实现无扩增直接单分子定量。

Q3. GeoMx DSP 技术可以同时检测 Protein 和 RNA 吗?

通常情况下,DSP 可以在组织切片上检测 Protein 和 RNA,但需要两张相邻的组织切片,一张切片做 RNA,另一张切片做 Protein. 两张切片使用同样的 Morphology (Imaging) Markers,同样的组织微环境高度可比,后续可以整合 Protein 和 RNA 表达数据。

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Q4. GeoMx DSP 蛋白质检测技术是否可以进行单细胞分析?需要选择的最少的细胞数目是多少?

DSP 蛋白质检测技术的目的是用来高分辨率解析复杂组织微环境中的不同细胞组成, 以及这些细胞亚群中不超过96 种蛋白质的空间原位表达谱。DSP技术本身具有在单个细胞水平上选择 ROIs 的分辨率,关于ROI 范围大小的问题,因为nCounter技术本身没有任何的PCR扩增步骤,我们需要在每一个ROI中收集到足够多的Oligo 标签来进行准确的96 种蛋白质的表达谱分析,因此,每个ROI中的最少细胞数其实和研究者要在空间中回答的生物学问题有直接关系。DSP 技术可以捕捉到单细胞水平的ROIs,如果使用 nCounter 技术定量,我们通常会推荐最少10-50个细胞的 ROI 大小做蛋白质检测。如果使用 NGS 技术定量,会引入 PCR 扩增步骤建库加入NGS Adaptor序列,需要的ROI大小可以比 nCounter 技术推荐的小一些。

Q5. 比起组织显微切割细胞进行空间检测,GeoMx DSP 有什么优势吗?

组织显微切割,用户需要将感兴趣的组织亚细胞群或区域切除收集,并经过复杂的自行优化或其他商业平台进行下游的RNA提取,反转录,扩增到最后的测序文库制备,然后进行RNA表达谱分析。这个过程首先会损坏组织切片,其次这个复杂的试验流程会引入各种偏差,并且成功率和数据重现性会是一个很大的挑战。DSP平台的推出,目的就是为了简化上述的复杂的流程,在不破坏珍贵样品组织切片的情况下,可以很容易的精准的用紫外光照射选取ROI,并进行下游的Protein和RNA的表达谱分析,组织切片可以重复利用来分析未收集过Oligo标签的其他ROIs, 也可以把DSP用过的切片样品用作其他蛋白质或核酸的检测。更重要的是,DSP 作为一个商业平台,高度整合了自动化的实验流程,大大简化手动步骤,确保了数据的准确性和高重复性,并推出经过了大量验证后的专注于多个领域的蛋白质 和RNA检测 Panels,能够直接被研究者用在免疫学、贝博ballbet免疫、和神经科学的研究中,再配合DSP平台的全套的数据整合和分析软件环境,能够帮助用户快速搭建自己的,从样品到分析结果的,多重空间蛋白质组和转录组的分析平台。


二、数字化空间转录组


在多细胞生物中,单个细胞的基因表达严格按特定的时间和空间顺序发生,即基因表达具有时间特异性和空间特异性。时间特异性可以通过对不同时间点的样本取材,使用单细胞转录组测序等技术来解析时间维度上细胞类型和基因表达模式。空间特异性则需要依靠空间转录组技术(Spatial Transcriptomics, ST)。空间转录组技术利用常规的原位技术和组学技术两方面的优势,将mRNA的空间信息与形态学内容相结合,并绘制所有基因表达发生的位置,获得疾病复杂而完整的基因表达图谱。在确定不同细胞群的同时保留空间位置,为细胞功能、表型和组织微环境中位置的关系提供了重要信息。

 

GeoMx Digital Spatial Profiler(DSP)空间转录组技术


GeoMx DSP数字空间分析技术是NanoString公司联合MD安德森等多家研究单位共同开发的一项全新的、基于光学与探针技术的蛋白质组学和转录组学的技术平台。该技术将表达谱的多重定量信息与组织原位信息进行整合,可在一张石蜡组织切片上实现多达上百种蛋白质和上万种RNA的原位共分析,将组织病理学、贝博ballbet免疫与表达谱完美结合,在贝博ballbet微环境研究、贝博ballbet异质性与贝博ballbet免疫研究中有着强大的优势。GeoMx DSP平台已经可以使用癌症转录组(Cancer Transcriptome Atlas, CTA)图谱分析1833个基因。最新推出的全转录组(Whole Transcriptome Atlas, WTA)图谱分析服务,可以提供多达18000+ 个编码基因的准确数据。


数字化空间转录组技术优势


1. 将组织病理学、贝博ballbet免疫与表达谱完美结合,在贝博ballbet微环境研究、贝博ballbet异质性与贝博ballbet免疫研究中有着强大的优势;

2. 可在一张石蜡组织切片上实现多达上万种蛋白质编码基因的原位共分析,覆盖超过100种贝博ballbet研究相关的代谢通路;

3. 匹配高通量测序仪进行计数定量,大大提高了检测通量和准确性;

4. 去除部分高丰度表达基因,提升了对低丰度表达基因检测灵敏性;

5. 可以额外提供多达60个定制靶标以满足个性化开发需求。


数字化空间转录组研究流程


3.1  DSP技术流程

待测RNA的探针通过 UV 可切割接头(Linker)共价连接到含有DNA Barcode(DNA条形码)的寡核苷酸链上。通过将荧光直标的形态学标志物(Morphology Marker)与这些探针同时进行孵育,再通过UV光解将兴趣点(ROI)的寡核酸链收集起来, 经过下游与NGS建库等试剂进行反应,再利用NGS测序平台进行数字量化,最后将数据返回到DSP进行分析,实现这些离散ROI内详细表达谱的信号解读。 (具体见图一)

图一 GeoMx DSP的简单技术流程

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3.2  实验流程

(1) 染色

FFPE 样本切片使用标准抗原修复流程,然后与荧光成像试剂(偶联有特定荧光染料的抗体)以及与偶联有寡核苷酸的 RNA 探针混合物进行孵育。

(2) ROI选择

DSP 可扫描多达 4 通道荧光的 20 倍图像。由荧光成像试剂建立组织的整体结构(例如,PanCK :上皮来源的细胞,包含贝博ballbet细胞、SYTO-13 :细胞核染料和 CD45: 免疫细胞)。基于荧光图像绘制或手动设置 ROI以进行多重分析。

(3) 局部寡核苷酸释放

对选定的 ROI 进行紫外光照射释放寡核苷酸链。

(4) 寡核苷酸收集

通过微毛细管(吸样针)收集已释放到载玻片上方水性液体中的光裂解寡核苷酸,并沉积在 96 孔板中用于后续定量。

(5) 寡核苷酸重复收集

针对不同的ROI进行局部紫外光照射和寡核苷酸收集(步骤 (3)-(5)),并在每个循环之间进行大量清洗。

(6) 定量

将收集的寡核苷酸(Oligo标签)与建库试剂在96孔中混匀后通过PCR进行建库。对得到的文库进行纯化、QC和测序。NGS测序结果被处理成数字计数并映射回每个ROI,生成组织结构内的基因表达图谱。转录组的表达矩阵将进行下游数据质控和分析。

 

3.3  数字化空间转录组信息分析流程

DSP数据分析是一个基于服务端的交互式分析系统,根据研究目的不同,开展以用户为主导的个性化分析,数据分析基本流程如下图所示: 

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3.3  数字化空间转录组信息分析内容

DSP数据分析软件可对数据进行处理和统计分析,并导出热图、箱线图、柱状图等适于文章发表的结果呈现形式,可以很精确地分析不同区域中的基因表达谱。通过不同质控的设定,包括 External RNA Control Consortium (ERCC) 以及管家基因(HK)等对照,来实现实验流程各个环节的把控。


3.3.1 标准分析

1. 数据QC质控和过滤

2. 数据标准化处理

3. 基因表达谱总览

4. PCA主成分分析

5. 样本 AOI/ROI 表达相关性分析

6. 贝博ballbet免疫微环境细胞丰度分析

7. 贝博ballbet免疫微环境细胞比例分析

8. 贝博ballbet免疫微环境细胞差异分析

9. 免疫+疾病+代谢等主要通路表达检测

10. 免疫+疾病+代谢等主要通路差异表达分析

11. 差异表达基因分析

12. 差异表达基因KEGG通路富集分析

13. 差异表达基因GO功能富集分析


3.3.2 定制化分析

可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析服务内容。

1. 分析结果示意图

Housekeeping Genes Gene Distribution

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所有分组基因表达热

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PCA降维

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AOI/ROI相关性分析

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 Pathway Signature 热图聚类

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数字化空间转录组检测产品

样本要求

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产品服务列表

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产品服务流程

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项目周期

标准流程从样本接收质控合格到数据交付(包括样品HE质控时间),运转周期约为2个月(40个工作日), 每批次96AOIs以上需额外增加时长,选择个性化信息分析条目需额外评估项目周期。

 

交付指标和售后服务

6. 根据合同规定完成分析。

7. 提交项目结题报告文档,说明项目完成情况。

8. 分析过程中产生的项目结题报告、下机原始数据以及相关生物信息分析结果文件。如果数据量小于100G,使用阿里云提供;因网络等原因无法顺利下载的,可提供移动硬盘传输;如果数据量大于100G,所有数据将会使用移动硬盘传输。

9. 数据交付后6个月内,提供免费的项目咨询服务。

10. 最终数据提供后,可继续保留数据3个月,如需延长数据保存时间需做费用评估。

 

产品服务优势

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案例分析


前列腺癌转移组织异质性研究


研究背景:

不同个体之间同一器官的癌症致癌和贝博ballbet抑制基因具有多样性。虽然激光辅助显微切割、蛋白质组学、单细胞测序和空间转录组学等先进技术的应用已经描绘了局限性前列腺癌(Localized Prostate Cancer)的分子多样性,但对转移性前列腺癌(Metastatic Prostate Cancer,mPC) 贝博ballbet间和贝博ballbet内的异质性还缺乏了解。

研究思路:

1)取27例mPC患者不同的贝博ballbet扩散部位,构建FFPE 组织芯片 (TMAs);

2)每个病人取两个不同的转移部位,以评估个体内异质性;

3)从每个贝博ballbet上取三个不同的空间区域,以评估贝博ballbet内的异质性。共采集56个mPC贝博ballbet的168个贝博ballbet核心区样本。

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研究结果:

1)通过DSP技术来定量转录本和蛋白质丰度,通过评估多个转移瘤的多个离散区域,发现贝博ballbet表型在患者内部具有高度的同质性。也有明显的例外,包括由高和低雄激素受体(AR)和神经内分泌活性区域组成的贝博ballbet;

2)虽然绝大多数的转移瘤没有明显的炎症浸润,且缺乏PD1、PD-L1和CTLA4,但B7-H3/CD276免疫检查点蛋白质高度表达,特别是在具有高AR活性的mPCs中;

3)以上的结果证明了DSP在精确分类贝博ballbet表型、评估贝博ballbet异质性和识别转移瘤免疫成分等贝博ballbet生物学方面的用途。

Brady L, et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling[J]. Nature Communications, 2021, 12(1).

影响因子:14.919


常见问题 FAQs


Q1. 什么样品类型适合使用 GeoMx DSP 技术进行空间信息分析?

DSP 技术可以用于各种组织类型: 包括正电荷粘附载玻片固定的 (+ charged slides mounted) 石蜡包埋组织 (FFPE) 切片和新鲜冻存(FF)组织切片。 在 NanoString 总部的 TAP (Technical Access Program) 服务项目中,已经在 DSP 上成功验证过 55 种以上的各类贝博ballbet组织,如下图所示,包括贝博ballbet组织、 穿刺样品、 骨髓和皮肤等各类组织。 DSP 也兼容各类样品类型,包括 FFPE,  Fresh Frozen,Tissue Microarrays 和 Cell Culture Slides。 具体可执行样本类型,请咨询当地业务负责人。

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Q2. 如果采用 GeoMx DSP 分析 RNA 空间表达,下游用 NGS 测序技术定量 Oligo 标签,是否需要反转录步骤?推荐的 NGS 测序读长是多少?

根据DSP的技术原理,其下游 Oligo 标签是DNA寡核苷酸组成的,如果利用NGS测序技术对其进行定量,无需反转录过程,直接一步 PCR 引入 NGS 文库兼容的接头序列即可得到可上机测序的文库结构。检测的RNA 探针上偶联的 Oligo 标签序列包含了 UMI (Unique Molecular Index)序列和 RNA ID 识别序列,推荐的最短测序读长为双端测序 2 × 27 bp。

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Q3. GeoMx DSP 技术可以同时检测 Protein 和 RNA 吗?

通常情况下,DSP 可以在组织切片上检测 Protein 和 RNA,但需要两张相邻的组织切片,一张切片做 RNA,另一张切片做 Protein. 两张切片使用同样的 morphology (Imaging) markers,同样的组织微环境高度可比,后续可以整合 Protein 和 RNA 表达数据。

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Q4. 比起组织显微切割细胞进行空间检测,GeoMx DSP 有什么优势吗?

组织显微切割,用户需要将感兴趣的组织亚细胞群或区域切除收集,并经过复杂的自行优化或其他商业平台进行下游的 RNA 提取、反转录、 扩增到最后的测序文库制备,然后进行 RNA 表达谱分析。这个过程首先会损坏组织切片,其次这个复杂的试验流程会引入各种偏差,并且成功率和数据重现性会是一个很大的挑战。DSP 平台的推出目的就是为了简化上述的复杂的流程,在不破坏珍贵样品组织切片的情况下,可以很容易的精准的用紫外光照射选取 ROI,并进行下游的蛋白质和 RNA 的表达谱分析,组织切片可以重复利用来分析未收集过 Oligo 标签的其他 ROIs, 也可以把 DSP 用过的切片样品用作其他蛋白质或核酸的检测。更重要的是,DSP 作为一个商业平台,高度整合了自动化的实验流程,大大简化手动步骤,确保了数据的准确性和高重复性,并推出经过了大量验证后的专注于多个领域的蛋白质和 RNA Panels,能够直接被研究者用在免疫学、 贝博ballbet免疫和神经科学的研究中,再配合 DSP 平台全套的数据整合和分析软件环境,能够帮助用户快速搭建自己的,从样品到分析结果的,多重空间蛋白质组和转录组的分析平台。

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